trừu tượng

Để nghiên cứu các cơ chế tạo apoptosis cơ bạn dạng trong những tế bào ung thỏng vú, staurosporine đã có được áp dụng như một kích thích apoptotic trong số chiếc tế bào ung thỏng vú MCF-7 và T47D. Staurosporine gây ra tăng liều và dựa vào thời gian vào phân mhình họa DNA đã trở nên hủy bỏ vị z-VAD-fmk. Các tế bào MCF-7 không bộc lộ caspase-3, cho thấy thêm sự phân mhình ảnh DNA xảy ra trong ngôi trường hợp không có caspase-3 cùng những caspase không giống hoàn toàn có thể tương quan. Staurosporine gây ra hoạt động DEVDase trong số tế bào T47D cho thấy sự ttê mê gia của caspase-3 và / hoặc caspase-7, cơ mà không có hoạt động DEVDase trong các tế bào MCF-7, rất có thể thải trừ sự tsi gia của caspase-7. Tuy nhiên, staurosporine gây nên sự phân cắt của pro-caspase-6 trong những tế bào MCF-7, cơ mà không hẳn trong số tế bào T47D. Sự phân bóc tách PARPhường phụ thuộc Caspase được vạc hiện trong các tế bào MCF-7 dịp 3h, trong lúc chỉ phân tách PARPhường 1 phần được phát hiện tại trong số tế bào T47D với tiếp đến chỉ sau 24 giờ đồng hồ. Hơn nữa, staurosporine vẫn dẫn tới sự việc gây ra cytochrom c vào lúc 2 giờ trong các tế bào MCF-7 với 6 giờ trong các tế bào T47D. Bên cạnh đó, sự bớt phụ thuộc vào thời gian và độc lập caspase của năng lượng điện núm màng vào ty thể đã có được quan liêu tiếp giáp thấy; xuất hiện thêm sau thời điểm tạo cytochrom c . Sự chuyển vị của Bax trường đoản cú cytosol sang ty thể đã được quan liền kề thấy ở 2 các loại tế bào cùng vấn đề đó đã chế tạo cytochrom c trong cả nhị tế bào T47D với MCF-7. Các sự kiện apoptotic trong cả nhị nhiều loại tế bào không giống nhau theo thời gian, liên quan tới sự việc kích hoạt những caspase khác biệt và biến đổi ty thể.

Bạn đang xem: Apoptotic là gì


Chủ yếu

Apoptosis là 1 quy trình rất cần thiết trong cả phát triển đa tế bào với gia hạn cân đối nội môi tế bào. ngoài ra, sự thất bại của các tế bào bị lỗi hại cần trải qua quy trình apoptosis góp phần vào sự tiến triển của ung thư vị nó được cho phép sự sống thọ của những tế bào bị hư hỏng DNA. Do đó, rất quyên tâm để hiểu tuyến phố truyền tín hiệu apoptotic trong những các loại ung thư khác biệt. Apoptosis được xác minh sắc thái vày sự co rút tế bào, sự bị chảy máu màng, ngưng tụ chromatin với ra đời các cơ sở apoptotic. Trung vai trung phong của quá trình apoptotic là 1 trong chúng ta protease cystein được call là caspase, là tác nhân quan trọng đặc biệt của quy trình bị tiêu diệt tế bào này. Caspase mãi sau vào tế bào bên dưới dạng các pro-enzyme không hoạt động rất có thể được kích hoạt bằng phương pháp cách xử lý xúc tác auto hoặc được kích hoạt vày một caspase không giống (Earnshaw et al, 1999). Các protease này có thể được phân một số loại thành hai nhóm: caspase 'initator', ví dụ caspase-8 và -9, bao gồm prodomains nhiều năm trên NH 2 -termini cùng có khả năng trường đoản cú phân bóc tách bên trên oligomeisation, và 'effector' caspase -3, -6 cùng -7 bao gồm các protên miền nđính với hoàn toàn có thể được kích hoạt vì chưng những caspase khởi tạo ra hoặc vì chưng các caspase kích hoạt (Thornberry cùng Lazebnik, 1998). Sau lúc được kích hoạt bởi vì những kích thích apoptotic, caspase đóng góp thêm phần vào sự biến hóa hình hài cùng sinh hóa của apoptosis bằng phương pháp xúc tác quá trình phân giải protein và vô hiệu hóa hóa những protein cấu tạo với điều tiết đặc trưng trong tế bào nlỗi, poly-ADP-ribose polymerase (PARP), gelsin nguyên tố phân mhình họa 45 kDa (DFF45) (Nunez et al, 1998).


Họ Bcl-2 tất cả những protein phòng (Bcl-2, Bcl-x L, Mcl-1) cùng pro-apoptotic (Bax, Bad, Bid) cũng tương đối đặc biệt vào vấn đề điều hòa sự bị tiêu diệt của tế bào. Các thành viên vào mái ấm gia đình Bcl-2 có công dụng xuất hiện những chất có tác dụng mờ đồng một số loại và dị đúng theo tử và phần trăm protein phòng cùng apoptotic hoàn toàn có thể ra quyết định định mệnh của tế bào (Reed, 1998). Những protein này hoàn toàn có thể là màng liên kết hoặc tế bào. Bcl-2 đã làm được minh chứng là được xác định vào lưới nội chất, màng ty thể với vỏ phân tử nhân (Krajewski et al, 1993), trong những khi những thành viên khác như Bax cùng thầu đa phần là tế bào học tập. Tuy nhiên, lúc khởi phát apoptosis, nội địa hóa một số member gia đình Bcl-2 đổi khác. ví dụ như, Bax đã được chứng minh là gửi trường đoản cú cytosol sang trọng màng ty thể sau khoản thời gian chữa bệnh bằng một kích thích apoptotic (Zhang et al, 1998), và gây ra sự giải phóng cytochrom c và kích hoạt caspase tiếp nối. Do sự đa dạng và phong phú vào chức năng của bọn chúng, những protein này tạo thành một điểm điều tiết đặc biệt quan trọng vào tuyến phố apoptotic.


Một sự đổi khác trong công dụng của ty thể đã có được minh chứng là đóng góp một mục đích đặc biệt quan trọng vào quy trình tiến độ tác động của tuyến đường apoptotic. Việc bớt năng lượng điện gắng màng trong ty thể (m) và giải pđợi protein cytochrom c của ty thể thường xuyên được quan sát thấy vào quy trình apoptosis (Zamzamày et al, 1995; Liu et al, 1996). Lúc tạo ra apoptosis cytochrom c được giải pchờ từ không khí thân màng tế bào vào tế bào chất địa điểm nó dẫn mang đến kích hoạt caspase và bị tiêu diệt tế bào kế tiếp (Liu et al, 1996). Sự phá vỡ lẽ tiềm năng xuyên màng của ty thể được cho là qua trung gian bởi câu hỏi mở một kênh dẫn lớn được hotline là lỗ chân lông chuyến qua thnóng qua ti thể (PTP) (Zamzami et al, 1996). Các nghiên cứu sẽ chỉ ra rằng vấn đề tạo cytochrom c xẩy ra vào ngôi trường đúng theo không tồn tại hoặc trước sự việc cách trở ΔΨm (Bossy-Wetzel et al, 1998; Goldstein et al, 2000), mặc dù lý lẽ đúng chuẩn của câu hỏi xây cất cytochrom c vẫn không chắc hẳn rằng. Tác dụng kháng apoptotic của Bcl-2 và Bcl-x L đã có chứng minh là tất cả tương quan đến sự việc ngăn ngừa sự giải pngóng cytochrom c cùng mất whereasm trong lúc Bax prooptotic hoàn toàn có thể gây ra đầy đủ đổi khác ty thể này (Decaudin et al, 1997; Yang et al, 1997 ; Jurgensmeier et al, 1998).


Thđọng từ bỏ của những sự khiếu nại apoptotic có lẽ khôn xiết không giống nhau tùy trực thuộc vào nền tảng gốc rễ tế bào với kích say mê apoptotic. Do đó, điều quan trọng là yêu cầu hiểu những yếu tố phân tử của bộ máy bị tiêu diệt của tế bào nhằm cung ứng vấn đề tùy chỉnh thiết lập can thiệp trị liệu thích hợp. Thật vậy, những nghiên cứu và phân tích vứt bỏ caspase sẽ cho rằng chưa hẳn tất cả những caspase đông đảo quan trọng đến quá trình apoptosis (Zheng et al, 1999). Caspase-3 đã được chứng tỏ là nhập vai trò trung chổ chính giữa trong những sự khiếu nại apoptotic quan trọng nhỏng sự phân mhình họa DNA cùng sự chảy máu màng, với con chuột caspase-3 null bị tiêu diệt thường niên với hiển thị vô cùng tế bào (Woo et al, 1998). Các tế bào ung tlỗi vú MCF-7 cũng thiếu hụt protein caspase-3, nhưng lại bọn chúng vẫn đáp ứng nhu cầu với rất nhiều kích ưa thích apoptotic cho biết thêm sự dư vượt công dụng vào bọn họ caspase (Janicke et al, 1998a). Nghiên cứu vớt này nhằm mục tiêu mục tiêu nghiên cứu các nguyên lý truyền biểu lộ apoptotic nội bào làm việc T47D (caspase-3 dương tính) và MCF-7 (caspase-3 âm tính) để thỏa mãn nhu cầu cùng với hóa học ức chế protein kinase nói tầm thường và kích say mê apoptotic, staurosporine (STS). Chúng tôi thấy rằng, trong hai các loại khối u rắn giống như này, sự biệt lập sống thọ trong các chế độ nhưng mà bọn chúng trải qua quy trình apoptosis. Kết quả của chúng tôi cho biết thêm lý lẽ bị tiêu diệt tế bào biệt lập về khía cạnh cồn học tập với những sự kiện xảy ra nhanh chóng hơn trong những tế bào MCF-7, đối với những tế bào T47D. Ngoài ra, vấn đề đó liên quan tới sự việc kiến tạo cytochrom c, làm cho sút tiềm năng màng trong ty thể (ΔΨm) với kích hoạt những kỹ lưỡng không giống nhau của dòng thác caspase.


Vật liệu cùng phương pháp

Ngulặng vật liệu

Staurosporine (STS) và z-VAD-fmk tới từ cửa hàng hóa sinh học tập (Nottingtê mê, Vương quốc Anh). E. Coli . DNA polymerase 1 và tất cả các môi trường nuôi cấy và ngày tiết tkhô hanh được đem từ Gibco BRL (Paisley, Vương quốc Anh). Kháng thể đối chọi dòng ngăn chặn lại Bcl-2, phòng thể đa chiếc phòng Bcl-x L và kháng thể đa dòng cùng với caspase-6 được lấy từ Santa Cruz Biotech Inc., (California, Hoa Kỳ). Kháng thể đa dòng của thỏ so với Bax được download từ bỏ TCS Biologicals Ltd., (Buckingđê mê, UK). Kháng thể PARPhường, Bak cùng cytochrom c tới từ Pharminren (Oxford, Vương quốc Anh). Hệ thống khảo nghiệm CaspACE, Colorimetric đến từ Promega, (Southampton, UK). Bộ chính sách ELISA chết tế bào với viên thuốc cocktail protease là của Boehringer Mannhelặng, (East Sussex, UK). Hệ thống ECL được lấy từ bỏ Amerssay mê, (Buckinghamshire, Vương quốc Anh).

Nuôi cấy tế bào

Các loại tế bào ung tlỗi vú sống tín đồ T47D (ung thư biểu mô ống) với MCF-7 (adenocarcinoma) được duy trì trong Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) được bổ sung cập nhật 10% (v v −1 ) huyết thanh hao tnhị nhi (FCS) với 2 m m glutamine. Các tế bào được gia hạn ngơi nghỉ 37 ° C vào môi trường bầu không khí độ ẩm / CO 2 (19: 1). Các tế bào được ủ cùng với môi trường thiên nhiên 1% FCS DMEM vào thời gian thí nghiệm cho các lần được hướng đẫn.


Dịch nichồng tại nơi (ISNT)

Các tế bào được ủ cùng với staurosporine cho những thời gian khác nhau Khi có hoặc không tồn tại z-VAD-fmk. Các tế bào kết dán và bóc tách rời được gộp lại với được cố định vào 1% paraformaldehyd với được thnóng vào ethanol 70% sống −đôi mươi ° C. Các tế bào sau đó được rửa vào PBS cùng ủ sống ánh nắng mặt trời chống vào 4 giờ cùng với cỗ đệm dịch niông chồng (50 m M TRIS, 10 μg ml −1 albumin ngày tiết tkhô giòn trườn (BSA), 2, 5 m M MgCl 2. 6H 2 O, 10 m M -mercaptoethanol) đựng E. Coli DNA polymerase (1 đơn vị), 0, 2 n M biotin-dUTPhường. cùng 0, 2 n M mỗi dATPhường, dGTPhường và dCTP. Các mẫu được rửa với chào bán lại vào dung dịch nhuộm (NaCl 600 m, natri citrat 60 m, Triton X-100 0, 1%, sữa khô không béo 5% (Marvel)) bổ sung cập nhật 2, 5 μg ml −1 avidin-FITC. Các mẫu kế tiếp được rửa với so sánh bởi Flow Cytometry. Các phần chủng loại của một số chủng loại nhất quyết (100 μl) được nhuộm bằng 1 mlg ml −1 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), cytospun trên những phiến kính và hiển thị bên dưới kính hiển vi huỳnh quang đãng bởi Phần mượt IP Lab Spectrum (Signal Analytics, bigbiglands.comnna, VA, Hoa Kỳ) mang lại hình thái phân tử nhân apoptotic.

Xem thêm: Năng LựC Giao Thoa Văn Hóa Là Gì

ELISA phân mhình ảnh DNA (Boehringer Mannheim)

Xét nghiệm này đo những đoạn DNA link với tế bào chất (mono- cùng oligonucleosome) được tạo nên vào quy trình apoptosis (Boehringer Mannheim). Sự có tác dụng giàu của các nhiễm nhan sắc thể trong tế bào hóa học của những tế bào được khám chữa được biểu thị bởi chạm màn hình gấp vào apoptosis đối với những đối bệnh không được điều trị. Các tế bào (1 × 10 5 ) được ủ với cùng 1 μ M STS, được rửa vào PBS và tiếp đến được thanh lọc vào bộ đệm ly giải vào 1/2 tiếng. Chất điển hình (triết xuất tế bào chất) đã có phục sinh và xét nghiệm được thực hiện theo giao thức ở trong phòng phân phối.

Xét nghiệm Prúc lục-V-FITC (BioSource International Inc)

Các tế bào (5 × 10 5 ) được giải pháp xử lý với một μ M STS cho những lần chỉ định. Các tế bào kết dán và bóc tách tách được gộp lại, cọ sạch cùng sau đó được nối lại vào bộ đệm liên kết (hỗn hợp đệm 10 m M HEPES / NaOH, pH 7.4, 140 m M NaCl, 2, 5 m M CaCl 2 ) và kháng thể annexin-V-FITC (5 μl) và ủ trong 10 phút ngơi nghỉ ánh nắng mặt trời phòng. Các tế bào được rửa với hồi lưu lại trong bộ đệm liên kết bao gồm đựng propidium iodide (PI) (10 μl) để cho nồng độ sau cùng là 1 trong μg ml 1 PI trước lúc phân tích bằng phép đo tế bào học. Phân tích Bivariant của FITC-huỳnh quang (FL-1) với PI-huỳnh quang quẻ (FL-3) vẫn cho những quần thể tế bào khác nhau trong số đó FITC −ve sầu và PI ve sầu được hướng dẫn và chỉ định là các tế bào khả thi; FITC + ve sầu cùng PI bao gồm mẫu mã hình là những tế bào apoptotic, cùng FITC + ve sầu với PI + ve sầu là những tế bào apoptotic hoặc hoại tử muộn.

Xét nghiệm hoạt động Caspase (Promega)

Hệ thống khảo nghiệm CaspACE được sử dụng nhằm phạt hiện tại chuyển động DEVDase (caspase-3/7). Các tế bào được giải pháp xử lý với cùng một μ M STS cùng được lọc vào bộ đệm ly giải tự bộ luật pháp. Hàm lượng protein đã có xác minh và lysates được ủ cùng với Ac-DEVD-pNA vào 4 tiếng sinh hoạt ánh nắng mặt trời phòng. Sản phẩm bội nghịch ứng được phân phát hiện nay ngơi nghỉ bước sóng 405nm bằng cách thực hiện đầu phát âm đĩa auto của năm 2001 (Công cố kỉnh của Lab Lab, Vương quốc Anh).

Phân tích tế bào học tập của điện nạm màng ty thể (m)

Để đo m, những tế bào (5 × 10 5 ) được ủ với 40 n M 3, 3-dihexyloxacarbocyanine iodide (DiOC 6 (3)) trong 20 phút ít sinh sống 37 ° C. Như một phương án kiểm soát và điều hành tích cực để cho biết sự suy sút hoàn toàn m, fan tách rời ty thể, carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCPhường sinh hoạt 50 M) đã có áp dụng. Propidium Iodide (PI) đã có cung ứng trước khi so sánh FACS nhỏng là 1 thước đo kĩ năng sống của tế bào. Độ huỳnh quang quẻ của tổng quần thể tế bào được đo bằng DiOC 6 (3) sống huỳnh quang xanh (FL-1) và PI sinh hoạt huỳnh quang đỏ (FL-3) bởi FACScan bởi ứng dụng CellQuest (Becton Dickinson).

Tây phương

Các tế bào được cách xử lý với cùng 1 μ M STS trong số khoảng chừng thời hạn khác biệt, tiếp đến được cọ trong nước đá mát PBS với được lọc trong đôi mươi phút ít trên nước đá trong dung dịch đệm (50 m M Tris.HCl, pH 7.4, 150 m M NaCl, 1% (v v 1 ) NP-40, 0, 625% natri deoxycholate, 1 m M NaF, 1 m M Na 3 VO 4, 1 viên cocktail protease (Boehringer Mannheim)). Lượng đều nhau của tổng thể protein (30 μg) đã trở nên 14% (protein gia đình Bcl-2, cytochrom c cùng cytochrom c oxyase), 8% (Poly ADP-Ribose Polymerase (PARP)) hoặc 10% (caspase-6) SDS CấmPAGE kế tiếp chuyển phương thơm Tây vào màng PVDF. Màng được ủ cùng với phòng thể chống lại Bcl-2, Bax, Bak với Bcl-x L, PARP, caspase-6 hoặc cytochrom c cùng được phạt hiện cùng với kháng thể phối kết hợp HRPhường sản phẩm công nghệ cung cấp đặc hiệu của loại. Protein được vạc hiện tại bằng khối hệ thống ECL (Amersđắm say, UK).

Các kết quả

Staurosporine tạo ra apoptosis trong các tế bào ung thư vú nghỉ ngơi người T47D và MCF-7

Các nghiên cứu và phân tích về apoptosis, được xác minh vì chưng sự phân mhình ảnh DNA (ISNT), vẫn minh chứng rằng những tế bào T47D với MCF-7, Khi tiếp xúc với STS (0, 2 Nott1 μ M), cho biết sự tăng thêm nhờ vào vào độ đậm đặc vào apoptosis, cùng với tác dụng về tối đa cho tất cả nhị tế bào tại 1 μ M STS (tài liệu ko được hiển thị). Apoptosis cũng là một trong những quá trình dựa vào vào thời hạn. khi xúc tiếp với cùng 1 μ M STS, sự tăng thêm đáng kể những tế bào hiển thị sự phân mhình họa DNA là rõ ràng vào thời gian 14 giờ đồng hồ trong những tế bào T47D, nhưng lại phần lớn chuyển đổi apoptotic đã có được phạt hiện nhanh nhất là 4 giờ trong những tế bào MCF-7 (Hình 1A). Chúng tôi đang khám nghiệm thêm sự phân mảnh DNA bằng ELISA chết tế bào. Các tác dụng được trình bày vào Hình 1B cho biết thêm sự gia tăng phụ thuộc vào thời gian với sự hiện hữu của các solo nhân cùng oligo-nucleosome giống như nlỗi vẫn thấy với ISNT ở hai loại tế bào, cùng với các tế bào MCF-7 bộc lộ mức độ apoptosis cao hơn. Hiệu ứng apoptotic đã làm được chứng thực bởi hình hài phân tử nhân (Hình 1C), với cả nhì loại tế bào cho thấy sự dừng tụ phân tử nhân cùng nhiễm nhan sắc thể nhỏ tuổi rộng dẫn đến sự hình thành hình lưỡi liềm bao phủ nước ngoài vi của hạt nhân. Tuy nhiên, các tế bào T47D hiển thị sự xuất hiện khung hình apoptotic tuy vậy điều đó không có trong số tế bào MCF-7 (Hình 1C). ngoại giả, sự thay đổi màng huyết tương, ví dụ như tiếp xúc cùng với dư lượng phosphatidyl-serine (PS) với bề mặt bên phía ngoài của màng plasma là ví dụ trong quá trình apoptosis tạo ra vì STS. STS tạo ra sự tăng thêm liên kết của annexin-V trong số tế bào MCF-7 sau 4 giờ chữa bệnh với liên tiếp tăng, tuy vậy vấn đề đó xảy ra kế tiếp trong những tế bào T47D trong số ấy link annexin-V đáng chú ý giành được 12 tiếng sau 1 μ M STS (Hình 2 ). Không bao gồm chuyển đổi như thế nào trong liên kết annexin-V được phân phát hiện trước 12 giờ vào ô T47D (tài liệu không được hiển thị). Điều này minh chứng rằng sự đổi khác màng plasma rất có thể xẩy ra ngay trước khi phân mhình họa DNA trong các tế bào T47D, tuy nhiên, trong những tế bào MCF-7, hầu hết đổi khác này có lẽ xẩy ra đôi khi.

*

Staurosporine gây nên apoptosis trong số tế bào ung thư vú ở bạn T47D và MCF-7. ( A ) Các tế bào được xử lý với 1 μ M STS cho những lần được hướng đẫn cùng apoptosis được khẳng định bằng phân mảnh DNA (ISNT) bên trên các tế bào thắt chặt và cố định cùng được thnóng. Dữ liệu được trình diễn theo Tỷ Lệ phân mảnh DNA: những tkhô hanh lỗi bộc lộ quý hiếm vừa phải ± sem của bố nghiên cứu độc lập. ( B ) Các tế bào được xử trí với một μ M STS cho những lần được chỉ định, lysates được đối chiếu bởi ELISA theo hướng dẫn ở trong phòng chế tạo. Cảm ứng cấp trong apoptosis được thể hiện bởi con số tinh vi DNA-histone tế bào hóa học trong số tế bào được điều trị so với những đối hội chứng ko được chữa bệnh. Các tkhô hanh lỗi thay mặt đại diện mang đến quý hiếm vừa đủ ± sem của tía nghiên cứu chủ quyền trong số đó * biểu hiện nấc tăng apoptosis đáng chú ý về mặt những thống kê đối với kiểm soát và điều hành ko được chữa bệnh (0 h), (ANOVA: F = 5, 44, P 1 DAPI. Các tế bào sau đó được so sánh bằng kính hiển vi huỳnh quang đãng.

Bài viết liên quan

Trả lời

Email của bạn sẽ không được hiển thị công khai. Các trường bắt buộc được đánh dấu *